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在ELISA試劑盒中通常有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶聯(lián)絡(luò)物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留心不可濺起，不可發(fā)生氣泡。
加標(biāo)本通常用微量加樣器，按規(guī)矩的量參與板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，避免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。
有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)矩的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參與稀釋液，再在其間參與血清標(biāo)本，然后在微型轟動器上轟動1分鐘以確保混和。加酶聯(lián)絡(luò)物使用液和底物使用液時可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程靈敏結(jié)束。在ELISA試劑盒中通常有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶聯(lián)絡(luò)物后。抗原抗體反應(yīng)的結(jié)束需要有一定的溫度和時間，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA查看試劑盒中似不恰當(dāng)。
ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的聯(lián)絡(luò)只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，參與板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有對等的和固相抗聯(lián)絡(luò)的機(jī)遇，只需zui靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐，因此需經(jīng)分散
才能到達(dá)反應(yīng)的結(jié)束。在這以后參與的酶符號抗體與固相抗原的聯(lián)絡(luò)也相同如此。這便是為何ELISA查看試劑盒反應(yīng)老是需要一定時間的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體聯(lián)絡(luò)的適合溫度。在樹立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，試驗標(biāo)明，兩次抗原抗體反應(yīng)通常在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中，以形成zui多的堆積。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中通常不予選用。
ELISA試劑盒的質(zhì)量凹凸要素取決于這兩個方面
  1.選材目標(biāo)。
  2.選材進(jìn)程。
胎牛血清用于選材的胎牛應(yīng)健康無病并且在的出生天數(shù)以內(nèi)，選材進(jìn)程應(yīng)嚴(yán)峻按照操作規(guī)程實行，制備出的血清要經(jīng)過嚴(yán)峻的質(zhì)量判定。分外懇求有：
  a.要經(jīng)過濾膜過濾除菌，確保無菌；
  b.證明所用血清中不含對所出產(chǎn)疫苗病毒的按捺物；
  c.無細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家懇求無細(xì)菌噬菌體污染；
  d.對細(xì)胞有出色的支持繁衍作用；
  e.有必要來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應(yīng)具有恰當(dāng)?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。